谷胱甘肽过氧化物酶测定 过氧化氢酶测定方法

谷胱甘肽过氧化物酶测定 过氧化氢酶测定方法
细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)有两种,硒谷胱甘肽过氧化物酶(SeGSHPx)与非硒谷胱甘肽过氧化物酶(non-SeGSHPx),两者的区别在于其活性结构中是否含硒。non-SeGSHPx只能催化除H2O2外的过氧化物还原,而SeGSHPx则可催化H2O2及其他过氧化物还原。这里只介绍SeGSHPx的测定。
1.DTNB直接显色法原理是SeGSHPx催化H2O2及其他过氧化物还原的反应时,必须以GSH为底物,由GSH供氢,而GSH与5,5'-二硫代双,2-硝基苯甲酸(DTNB)生成黄色的5-硫代,2-硝基苯甲酸阴离子,测定该离子的浓度即可计算出GSH减少量,以此求得SeGSHPx活性。
2.酶偶联连续监测法原理是SeGSHPx催化H2O2及其他过氧化物使GSH氧化成GSSG,在NADPH及GSH还原酶作用下,GSSG重新转变为GSH,同时NADPH转变成NADP+,在这一过程中340nm处的光吸收下降,其下降程度可确定SeGSHPx活性。本法特异性强、灵敏度高,很适用酶含量不高的样品。但此法需GSH还原酶,后者的成本高是本法的缺点。
3.荧光测定法 原理源自于GSH的荧光分析法。
2GSH + H2O2 --→ GSSG +2H2O
GSH + OPA --→ 荧光复合物
随着反应的进行,GSH不断被消耗,经一定时间的酶反应后,中止反应,剩余的GSH与邻苯二甲醛(OPA)在一定pH条件下生成较特异性的荧光复合物,通过测定其荧光强度即可测定SeGSHPx活性。

  

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